DNA仅以5'到3'的方向复制，因为真核染色体的每个染色体都有许多来源，与它们更大的尺寸保持一致。如果某些方向被复制到其他方向，则会发生错误。它可以说每个细胞分裂在同一页面上。
因为DNA合成只能在5'到3'方向发生，所以当双螺旋打开时，第二个DNA聚合酶分子用于结合另一个模板链。该分子合成不连续的多核苷酸片段，称为冈崎片段。另一种叫做DNA连接酶的酶负责将这些片段拼接成所谓的后滞链。
DNA连接酶的机制是在一个核苷酸的3'羟基末端（“受体”）与另一个核苷酸末端（“供体”）之间形成两个共价磷酸二酯键。两个“粘性末端”必须在相反的方向上才能完成整个DNA分子的复制。
人类平均染色体含有大量的核苷酸对，每秒约50个碱基对被复制。然而，整个复制过程只需要大约一个小时。这是因为在真核染色体上存在许多复制起点位点。因此，复制可以在某些起源时早于其他起源。随着复制接近完成，新复制的DNA的“气泡”会合并融合，形成两个新分子。
